3-1- منبع گیاهی مورد استفاده23
3-2- روش کار23
3-3- محیط کشت24
3-3-1- آماده کردن محیط کشت24
3-3-2- ضدعفونی وسایل مورد نیاز24
3-3-3- آماده سازی هود (لامینار ایرفلو)25
3-3-4- آماده سازی محیط کشت کورم ارکیده25
3-3-5- آماده سازی کورم ارکیده26
3-4- چگونگی اندازه گیری صفت‌ها27
3-5- شرایط گلخانه ای28
3-6- تجزیه و تحلیل داده‌ها28
فصل چهارم29
نتایج و بحث29
ارزیابی صفات در محیط کشت درون شیشه ای29
طول گیاه30
طول ریشه32
تعداد کورم33
تعداد برگ35
تعداد ریشه37
وزن تر38
وزن خشک گیاه39
آزمایش دوم40
طول گیاه40
طول ریشه42
تعداد کورم44
تعداد برگ46
تعداد ریشه48
وزن تر گیاه49
وزن خشک گیاه51
فصل پنجم53
نتیجه گیری کلی53
منابع55
فهرست جداول
جدول4-1- جدول مقایسه میانگین اثر تیمار نانو کود بر طول گیاه31
جدول 4-2- جدول تجزیه واریانس اثر تیمار نانو کود بر طول گیاه31
جدول4-3- جدول مقایسه میانگین اثر تیمار نانو کود بر طول ریشه32
جدول 4-4- جدول تجزیه واریانس اثر تیمار نانو کود بر طول ریشه33
جدول4-5- جدول مقایسه میانگین اثر تیمار نانو کود بر تعداد کورم34
جدول 4-6- جدول تجزیه واریانس اثر تیمار نانو کود بر تعداد کورم34
جدول4-7- جدول مقایسه میانگین اثر تیمار نانو کود بر تعداد برگ36
جدول 4-8- جدول تجزیه واریانس اثر تیمار نانو کود بر تعداد برگ36
جدول4-9- جدول مقایسه میانگین اثر تیمار نانو کود بر تعداد ریشه37
جدول 4-10- جدول تجزیه واریانس اثر تیمار نانو کود بر تعداد ریشه37
جدول4-11- جدول مقایسه میانگین اثر تیمار نانو کود بر وزن تر38
جدول 4-12- جدول تجزیه واریانس اثر تیمار نانو کود بر وزن تر39
جدول4-13- جدول مقایسه میانگین اثر تیمار نانو کود بر وزن خشک40
جدول 4-14- جدول تجزیه واریانس اثر تیمار نانو کود بر وزن خشک40
جدول4-15- جدول مقایسه میانگین اثر تنظیم کننده‌های رشد بر طول گیاه41
جدول 4-16- جدول تجزیه واریانس اثر تنظیم کننده‌های رشد بر طول گیاه42
جدول4-17- جدول مقایسه میانگین اثر تنظیم کننده‌های رشد بر طول ریشه43
جدول 4-18- جدول تجزیه واریانس اثر تنظیم کننده‌های رشد بر طول ریشه44
جدول4-19- جدول مقایسه میانگین اثر تنظیم کننده‌های رشد بر تعداد کورم45
جدول 4-20- جدول تجزیه واریانس اثر تنظیم کننده‌های رشد بر تعداد کورم46
جدول4-21- جدول مقایسه میانگین اثر تنظیم کننده‌های رشد بر تعداد برگ47
جدول 4-22- جدول تجزیه واریانس اثر تنظیم کننده‌های رشد بر تعداد برگ47
جدول4-23- جدول مقایسه میانگین اثر تنظیم کننده‌های رشد بر تعداد ریشه49
جدول 4-24- جدول تجزیه واریانس اثر تنظیم کننده‌های رشد بر تعداد ریشه49
جدول4-25- جدول مقایسه میانگین اثر تنظیم کننده‌های رشد بر وزن تر51
جدول 4-26- جدول تجزیه واریانس اثر تنظیم کننده‌های رشد بر وزن تر51
جدول4-27- جدول مقایسه میانگین اثر تنظیم کننده‌های رشد بر وزن خشک52
فهرست نمودار
نمودار4-1- اثر نانوکود بر روی طول گیاه33
نمودار 4-2- اثر نانوکود بر روی طول ریشه34
نمودار 4-3- اثر نانوکود بر روی تعداد کورم35
نمودار 4-4- اثر نانوکود بر روی تعداد برگ36
نمودار 4-5- اثر تنظیم کننده‌های رشد بر روی طول گیاه40
نمودار 4-6- اثر تنظیم کننده‌های رشد بر روی طول ریشه41
نمودار 4-7- اثر تنظیم کننده‌های رشد بر روی تعداد کورم42
نمودار 4-8- اثر تنظیم کننده‌های رشد بر روی تعداد برگ44
نمودار 4-9- اثر تنظیم کننده‌های رشد بر روی وزن تر46
فهرست تصاویر
شکل3-1- ضدعفونی وسایل آزمایشگاهی و محیط کشت در اتوکلاو25
شکل3-2- آماده سازی هود لامینارفلو برای کشت25
شکل3-3- تهیه محیط کشت برای ارکید29
چکیده
این مطالعه بر پایه دو آزمایش طرح بلوک‌های کاملاً تصادفی بر روی ارکید Orchis catasetum که یک گونه در حال انقراض است انجام شد که آزمایش اول با 1 فاکتور نانو ذرات آهن با 4 سطح (0، 34/0، 69/0و 139/0میلی گرم بر لیتر) در 4 تیمار و 5 تکرار و 20 پلات آزمایشی و آزمایش دوم با 1 فاکتور مخلوطی از دو هورمون نفتالین استیک اسید و بنزیل آدنین با 4 سطح (5/0، 1 و2 میلی گرم بر لیتر) در 4 تیمار و 5 تکرار و 20 پلت آزمایشی انجام شد که در این آزمایش از محیط موراشیک و اسگوک به روش آبگونه استفاده شد و لازم به ذکر است که هر پلات آزمایشی شامل 4 کورم گیاه Orchids catasetum بوده که در داخل شیشه مربا قرار دادیم.
نتایج نشان داد که اثر سطوح مختلف نانو ذرات آهن بر روی صفات طول گیاه، طول ریشه، تعداد کورم و تعداد برگ در ارکیدOrchis catasetum معنیدار شد ولی بر روی بقیه صفات غیرمعنیدار بود. در حالی که اثر تنظیم کننده‌های رشد گیاهی بر روی صفات طول گیاه، طول ریشه، تعداد کورم، تعداد برگ و وزن تر معنیدار شد ولی بر روی بقیه صفات غیرمعنیدار بود.
کلمات کلیدی: Orchis catasetum ، تنظیم کننده‌های رشد گیاهی، محیط MS ، نانو کود آهن
فصل اول
مقدمه
انسان فطرتاً زیباییخواه است. دنیای پرزرق و برق امروز رقیب قدرتمندی برای گلهای طبیعی معرفی ننموده و هنوز هم انواع گل‌ها بسته به سلیقه مردم جوامع مختلف مورد توجه و علاقه انسانها هستند. بعضی گلها دارای محبوبیت جهانی هستند و روزانه میلیونها شاخه از آن‌ها تولید و مورد استفاده قرار می‌گیرند مثال شاخص این دسته از گلها دو خانواده بزرگ گل رز و گل ارکیده هستند.
گلهای خانواده ارکیده به دلیل تنوع بی نظیرشان در شکل، اندازه، رنگ و خصوصیات منحصر به فردی که دارند مورد علاقه دوستداران گل قرار دارند. در سالهای 551-479 کنفسیوس در نوشتارهای خود به ارکیده اشاره کرده است. او در مورد عطر ارکیدهها در منزل و استفاده تزئینی چینیها از این گل سخن به میان آورده است. یونانیها و رمیها به ارکیدها بیشتر از دید طبی می‌نگریستند. از سالهای 1370 به بعد به تدریج ارکیدهها به صورت امروزی مورد ارزیابی قرار گرفتند. در دهههای اول 1700 مبلغان مذهبی و دریانوردان ارکیدها را از نقاط مختلف دنیا به انگلستان آوردند و تولید گل بریده ارکیده از سال 1913 در سنگاپور آغاز شد و در حال حاضر تولید و عرضه این گل به صورت انبوه در تمام دنیا انجام می‌پذیرد.
اطلاعات گیاه شناسی
Gynandrales خانواده ارکیده، از راسته Orchidaceae بزرگ‌ترین خانواده نهاندانگان به شمار می‌رود که دارای بیش از 750 جنس و 1750 گونه می‌باشد و از جوانترین خانواده‌های گیاهی محسوب می‌شود.
این خانواده به 5 زیر تیره تقسیم می‌شود:
cypripedioideae
neotioideae
epidendoideae
vandoideae
orchidoideae
گیاهان این خانواده تک لپه، علفی و پایا هستند که به صورت انگل، ساپروفیت و خاکزی مشاهده می‌شوند. گلآذین به صورت خوشه یا سنبله و گل‌ها نامنظم هستند. هر گل شامل سه گلبرگ و سه کاسبرگ است که گلبرگ خلفی بزرگ‌تر شده و لابل را بوجود می‌آورد. در هر گل یک یا بندرت دو عدد پرچم زایا وجود دارد که در مقابل لابل قرار گرفته و پرچم‌های دیگر به صورت نازا یا استامینود درآمده و شامل دو کیسه متورم بنام bursicula است که به لبه میانی کلاله متصل می‌گردد.
تخمدان تحتانی، یک خانهای و تمکن کناری است که نسبت به محور گلآذین کاملا به طور وارونه قرار می‌گیرد. خامه متصل به پرچم‌ها بوده و ستونی بنام gynandrune به وجود می‌آورد که منتهی به کلاله سه لبه می‌شود که دو لب کناری قابلیت پذیرش دانه گرده را دارد. لب میانی قطعه نازایی بنام روستلوم rustellum را بوجود می‌آورد.
میوه کپسول در مجاورت محل جفت باز می‌شود. دانه‌ها بسیار ریز و شامل یک جنین مقدماتی هستند که در خارج از آلبومن قرار می‌گیرد. جنین مذبور برای رشد احتیاج به همیاری برخی از قارچ‌های خاکزی دارد که تشکیل میکوریز می‌دهند. ارکیدها خصوصیات منحصر به فردی دارند که باعث تمایز آن‌ها از دیگر خانواده‌ها و قرار گرفتنشان در یک خانواده می‌شود. گلهایzygomorphic نوعی خاص از گلهای نامنظم به شمار می‌روند که از نوعی تقارن محوری برخوردارند.
گرده
گرده گلهای ارکیده به کیسه‌های مخصوصی بنام pollinia چسبیده است. که حشرات گرده افشان بعداً آن‌ها را پس از گرده افشانی جدا می‌کنند که یکی از وجوه مشخصه شناسایی گل تعداد این کیسه‌ها می‌باشد.
اندام‌های تولید مثلی
اندام‌های تولید مثل این گل هر دو در ستونی متحد بنام gynandrune قرار دارند. این ستون حاوی یک بساک بارور در قسمت بالایی ستون و سطح مادگی در سطح زیرین ستون می‌باشد.

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

شاخکrostellum
در سطح زیرین ستون بین بساک پرچم و کلاله وجود دارد. این شاخک دو نقش منحصر بفرد را ایفا می‌کند اول اینکه چون سد و مانعی بین اندام زایای نر و ماده قرار گرفته بنابراین مانع خودباروری است. دوم شاخک غدهای است که تولید مادهای چسبنده می‌کند که حشرات را به سطح این اندام‌ها جلب می‌نماید و به نحوی عمل می‌کند که موقعی که حشره می‌خواهد از گرده استفاده کند این ماده به پشتش می‌چسبد.
بذرها
ارکیدها تعداد بسیار زیادی بذر تولید می‌کنند که بذر آن‌ها فاقد هرگونه اندوسپرم می‌باشند. از این رو در طبیعت برای سبز شدن ارکیدها به صورت انگلی، خاکزی یا terrestrial و اکثر ارکیدهایی که در مناطق حاره می‌رویند از نوع ارکیدهای مستقل دارزی یا کودرست یاepiphyte هستند. ارکیدها دارای دو نوع رشد هستند. فرم ایستاده یا monopodial و فرم ساقه خزنده یا sympodial . ریشه‌های هوایی در ارکیدها علاوه بر وظایف کلی ریشه‌ها در گیاهان که شامل پابرجایی و تغذیه گیاه است وظایف دیگری نیز دارد مثل ذخیره آب، ذخیره موادغذایی، تنفس و فتوسنتز که این خصوصیات ریشه ناشی از وجود velamen یک لایه اسفنجی و سفید رنگ است می‌باشد.
نکته جالب توجهی که در مورد ارکیدها وجود دارد و نشان از تکامل یافته بودن این خانواده گیاهی است گرده افشانی این گیاه است. تمام عوامل موجود در گل که ممکن است جنسی، شیمیایی ( نکتار ) و بویایی باشد فقط برای جلب یک حشره خاص عمل می‌کنند و در هر گونه حشره خاصی عمل گرده افشانی را انجام می‌دهد.
در برخی گونه‌ها لابل گل شبیه حشره ماده می‌شود و گیاه بویی را که شبیه بوی حشره ماده است برای گول زدن حشره نر ترشح می‌کند. حشره نر وقتی داخل گل می‌رود گیر می‌کند و حرکاتی که برای خارج شدن از گل انجام می‌دهد باعث پاشیده شدن pollinia و در نتیجه گرده افشانی گل می‌شود این مکانیسم زیرکانه توسط بعضی گونه‌های ارکید مثل Coryanthes ،Ophrys ،Drakea انجام می‌شود.
جنس‌های معروف ارکیده
1-Cattleya :
حدوداً60 گونه دارد و بومی مناطق استوایی است. دارای رنگ‌های متنوع، مانند سفید، ارغوانی، زرد و برخی دو رنگ هستند. برخی نیز دارای حساسیت فتوپریودیک بوده و در سال 2 بار گل می‌دهند. وبطور کلّی گیاه گلدانی جذابی را می‌سازند.
2- Phalaenopsis:
دارای 55 گونه بوده که بومی مجمع الجزایر مالزی و اقیانوسیه است. گل‌های سفید هیبرید P .amabilis در تمام طول سال در بازار آمریکا یافت می‌شود. این گل‌ها در رنگ صورتی و دیگر رنگ‌ها در طول پاییز و بهار یافت شده و بیشتر برای دسته گل به کار می‌روند.
3- Dendrobium:
دارای 900 گونه بوده و بومی مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری استرالیا و جزایراقیانوس آرام است. دارای گل‌های  با عمر طولانی جهت گل بریدنی است.
4- Vanda:
دارای گل‌های سه رنگ می‌باشد. نیاز به هوای گرم و مرطوب دارد.
5- Cymbidium:
دارای 40 گونه است و بومی مناطق گرمسیری آسیا واسترالیا می‌باشد. بر خلاف بقیه طالب مناطق خنک یا دمای شبانه 10 درجه و روزانه 24-21 درجه است. اغلب برای فروش در بهار پرورش داده می‌شود.
6- AScocenda:
این جنس درواقع دو رگه Vandaو Ascocentrum می باشد و حالتی شبیه Vanda مینیاتوری دارند.
7- Paphiopedilium:
بیشتر رقم‌های آن دو رگه می‌باشد که از آن جمله می‌توان P.insigne را نام برد. که برای بهترین گلدهی به شبهای خنک (10 درجه ) نیاز دارد. همچنین دارای انواع گرما دوستی همچونP.invium وP. callosum نیز می‌باشد. به طور کلی به عنوان گل گلدانی مورد استفاده است.
ازدیاد ارکیده‌ها به روش‌های زیر صورت می‌گیرد
1- بذرSeed، 2- تقسیمDividing، 3- Back –bulb propagation،
4- کشت بافت Tissue culture، 5- قلمه ساقه Stem propagation،
6- Inter node propagation ، 7- keikis ، 8- Top cuts.
کشت بافتگیاهی، به رشد مواد گیاهی عاری از عوامل بیماریزا در شرایط گندزدایی شده و درون بستر غذایی استریل که در ظروف آزمایشگاهی مثل لوله آزمایش اطلاق می‌گردد. کشت بافت گیاهی شامل کشت پرتوپلاست، سلول، بافت و اندامگیاهی است (باقری و همکاران،1383). بزرگ‌ترین مشوق برای استفاده از فنون کشت بافت گیاهی برای تکثیر بسیاری از گونه‌ها، ممکن است کار اولیه مورل روی تکثیر ارکیده در سال 1960 و کار موراشیک و اسگوک در 1964 در ایجاد محیط کشت جدیدی بوده باشد (معینی و کهریزی،1382). سیستمهای کشت بافت گیاهی به عنوان سیستمهای الگو برای بررسی‌های گوناگون فیزیولوژیکی، زیست شیمیایی، ژنتیکی و مشکلات ساختاری گیاهان نیز مورد استفاده قرار می‌گیرد. فنون کشت بافت گیاهی معمولا به عنوان ابزاری جهت ازدیاد رویشی گیاهان مهم اقتصادی و فراورده‌هایی که استفاده تجاری در آینده دارند به کار می‌رود (خشخوی ،1386). ارکیده یکی از گیاهان تجاری گلدانی و شاخه بریده مهم در دنیا می‌باشد (قهساره و کافی،1389). بذر ارکیده، خیلی ریز و ذخیره غذایی آن‌ها، خیلی کم و غالباً بدون ذخیره غذایی هستند. این اندازه کوچک بذر، باعث از دسترفتن آن‌ها در محیط کشت طبیعی می‌شود و به علاوه به دلیل محدود بودن ذخیره غذایی، زنده ماندن بذرها در محیط کشت طبیعی مشکل است بنابراین جوانهزنی و رشد رویشی در محیط کشت درون شیشهای بسیار موفقتر میباشد (باقری و صفاری ،1390 ). در محیط کشت درون شیشهای نیزعدم وجود کافی هورمون‌های رشد گیاهی باعث عدم بهبود ریزازدیادی در گیاهان می‌گردد که این موضوع به کمک تنظیم کننده‌های رشد گیاهی و بخصوص سایتوکنینها که نقش مهمی در پینهزایی و شاخسارهزایی دارند انجام می‌گردد. عدم بهبود تکثیر در محیط کشت معمولی یا درون شیشهای علاوه بر هزینههای گزاف، باعث کاهش سرعت، در صد جوانیزنی ونهایتًا باعث تاخیر یا کاهش در عملکرد گیاه می‌شود (اولسون،1974؛نگهدار و همکاران 1391 ). در فناوری نانو ذراتی با اندازه‌های بسیار کوچک ساخته می‌شوند که به دلیل کوچکی فوقالعادهشان دارای خواص جدیدی می‌باشند. فناوری نانو باعث ارتقاء سطح زندگی انسان‌ها می‌گردد. بخش کشاورزی از جمله مهم‌ترین عرصه‌هایی است که با استفاده از فناوری نانو، منافع زیادی را متوجه این بخش خواهد نمود. ورود اولین مجموعه از محصولات نانو در بخش کشاورزی شامل آفت کش‌ها و کودهای نسل جدید با کارایی غیر قابل تصور برای کنترل هوشمند آفات، بیماری‌ها و علف‌های هرز و تهیه داروهای نسل جدید به بازار باعث ارتقاء سطح تولید و کیفیت محصول می‌گردد (تیکنر و همکاران 2007). هدف از انجام این تحقیق بررسی نانو ذرات آهن بر روی ریز ازدیادی ارکیده به روش کشت مایع می‌باشد.
فصل دوم
بررسی منابع
1-1- محیطهای کشت در ریزازدیادی
انتخاب نوع محیط کشت، به اهداف مورد نظر در ریزازدیادی بستگی دارد و نسبت به نوع ریزنمونه و گونههای مختلف گیاهی از محیطهای کشت استاندارد و یا تغییر داده شده استفاده به عمل میآید. ابتدا از محیطهای کشت مختلف، محیط کشت پایه آماده میشود، و سپس با رقیق کردن آن‌ها در موارد مختلف استفاده میشود. از دو محیط کشت معروف میتوان به محیط کشت موراشیگ و اسکوگ (1962) اشاره کرد.
2-1- محیط کشت و مواد تشکیل دهنده آن
یکی از مهم‌ترین عوامل ایجاد رشد و اندامزایی در کشت بافت گیاهی، مواد تشکیل دهنده محیط کشت میباشد محیطکشت بافت گیاهی به طور کلی از بخشی یا تمام مواد زیر تشکیل شده است.
عناصر پرمصرف، عناصر کممصرف، ویتامینها، اسیدهایآمینه و دیگر مواد نیتروژندار، قندها، موادکندکننده رشد، مواد جامدکننده یا سیستم حمایتکننده مانند آگار، افزودنی‌های آلی نامشخص نظیر ذغال فعال وآب. به طور معمول چندین دستور تهیه برای بیشتر کارهای کشت بافت و سلول مورد استفاده قرار میگیرد. این دستورها در برگیرنده آنچه توسط وایت1، موراشیک و اسکوگ (MS) 2، گمبورگ و همکاران (B5)3، شنگ4 ، هیلدر برانت (SH)5 نیچ 6 و لویدومک کاون 7 پیشنهاد شده میباشند. محیط کشتهای MS ، SH و B5 همگی دارای مقادیر زیادی از عناصر پرمصرف میباشند. در حالی که در سایر محیطهای کشت عناصر پرمصرف به میزان قابل توجهی کمتر است.
1-2-1- عناصر پرمصرف و کممصرف
عناصر پرمصرف در برگیرنده شش عنصر اصلی نیتروژن، فسفر، پتانسیم، کلسیم، منیزیم و گوگرد میباشد که برای کشت بافت و سلول گیاهی مورد نیاز است. غلظت بهینه هر ماده غذایی برای دستیابی به میزان رشد حداکثر، به میزان زیادی بین گونههای گیاهی متفاوت است. پتاسیم برای رشد سلول بیشتر گونههای گیاهی مورد نیاز میباشد. بیشتر محیط کشتها، دارای پتاسیم به صورت نیترات و کلراید به غلظت 20 تا 30 میلیگرم میباشند. غلظت بهینه فسفر، منیزیم، گوگرد و کلسیم از 1 تا 3 میلیگرم در لیتر میباشد مشروط بر اینکه سایر نیازهای رشد سلولی تامین شده باشند. در صورتی که کمبود سایر مواد غذایی وجود داشته باشد، غلظتهای بالاتری از مواد اشاره شده لازم است (تورز، 1377).
عناصر کممصرف اصلی برای کشتبافت و سلولهای گیاهی در برگیرنده آهن، منگنز، روی، بر، مس و مولیبدن میباشند. در حالت عادی، برای تهیه محیط کشت، شکلهای کلات آهن و روی مورد استفاده قرار میگیرد. آهن ممکن است مهم‌ترین عنصر کممصرف باشد. سیترات و تارتارات آهن نیز ممکن است در محیط کشت به کار روند، اما این ترکیب به سختی در آب حل میشوند و معمولاً پس از تهیه کشت رسوب میکنند. امکان افزودن کبالت و ید به برخی از محیطهای کشت وجود دارد اما نیاز مبرم به این عناصر برای رشد سلول گیاهی ثابت نشده است. سدیم و کلر نیز در برخی از محیط کشتها به کار میروند، اما نیاز اساسی به آن‌ها برای رشدیاختهها وجود ندارد. مس و کبالت در حالت عادی به غلظت 1/0 میکرومول به محیط کشت افزوده میشود (برگ و والنتین، 1976، بیک و استرابر، 1978، بیک و همکاران، 1960 ).
1-2-3- کربوهیدرات‌ها
کربوهیدرات‌ها جزء بسیار مهمی در هر نوع محیط کشت است، چون معمولاً شرایط رشد برای فتوسنتز کافی نیست. یا اصولاً به علت تاریکی، فتوسنتز انجام نمیشود. اضافهکردن هیدراتهایکربن، در واقع قندها به محیطکشت ضروری است. از میان کربوهیدرات‌ها ساکاروز ترجیح داده میشود. گلوکز و فروکتوز در برخی از موارد میتواند جایگزین شود. گلوکز به اندازه سوکروز موثر است و فروکتوز تا حدودی اثر کمتری دارد. غلظت ساکاروز در محیط کشت در حالت عادی بین 2 تا 4 درصد است. کربوهیدرات‌ها پس از ساخته شدن محیط کشت و قبل از اندازه گرفتن اسیدیته به محیط کشت افزوده میشوند (آزادی و معینی،1380، تورز،1377 و هارتمن و همکاران، 1378).
1-2-4 -ویتامینها
ویتامینهایی که بیشتر در محیط کشت بافت و سلول به کار میروند عبارت‌اند از : تیامین، اسیدنیکوتینیک، پیریدوکسین، میواینوزیتول و در برخی محیط کشتها اسید اسکوربیک.
استفاده از تیامین تقریباً الزامی است و اسید نیکوتینیک و پیریدوکسین به دلیل نیاز برخی از بافتهای گیاهی به طور معمول به محیط کشت افزوده میشوند. استفاده از اسید اسکوربیک به معنای نیاز گیاه نبوده و به عنوان آنتیاکسیدانت به کار میرود.
میواینوزیتول یکی از اجزای فعال شیره نارگیل میباشد و به طور معمول در بسیاری از محلولهای ویتامیندار استفاده میشود. وجود میواینوزیتول در محیط کشت الزامی نیست اما در مقادیر کم رشد سلولی را در بیشتر گونهها تحریک میکند (پیریک، 1376 ، تورز،1377 ، واعظ لیواری،1381 و هارتمن و همکاران، 1378).
1-2-5- اسیدهای آمینه و سایر افزودنیهای نیتروژن دار
با آنکه یاختههای کشت شده به طور عادی قادر به سنتز تمام اسیدهای آمینه مورد نیاز خود هستند، افزودن برخی از اسیدهای آمینه یا آمیزهای از اسیدهای آمینه ممکن است موجب رشد بیشتر سلولها شود. کاربرد اسیدهای آمینه به ویژه برای کشتهای سلولی و پرتوپلاست اهمیت دارد. گلوتامین متداول‌ترین منبع ازت است اگرچه از آدنین و آسپارژین نیز میتوان استفاده کرد (پیریک، 1376 ، تورز،1377).
1-2-6- مواد جامدکننده یا سیستم حمایتکننده
آگار 8 یکی از مشتقات نوعی علف هرز دریایی است و میتواند به صورت مادهای مولد ژل در اکثر محیطهای کشت به کار رود. هنگام آمیختهشدن آگار با آب ژلی تولید میشود که در دمای حدود 60 تا 100 درجه سانتیگراد ذوب شده و در دمای 45 درجه سانتیگراد جامد میگردد. از این رو ژل آگار با تمام دماهای نگهداری، سازگاری دارد. افزون بر این، آگار واکنشی با مواد تشکیلدهنده ومحیط کشت نداشته و توسط آنزیمهای گیاهی جذب نمیشود. سفتی ژل آگار بستگی به غلظت و نوع آگاری که در محیط کشت به کار رفته و نیز pHمحیط کشت دارد.
غلظتهایی از آگار که به طور معمول در محیطهای کشت یاخته گیاهی به کار میرود بین 6/0 تا 8/0 درصد است. اگر غلظت کمتر (4/0 %) بکار رود محیط کشت خصوصاً زمانی که pH پائین است خوب سفت نمیشود و اگر غلظت بالاتر انتخاب شود محیط کشت خیلی سفت شده و قرار دادن ریزنمونه را مشکل میسازد (واعظ لیواری،1381).
1-2-7- تنظیم کنندههای رشد
تنظیمکنندههای رشد گیاهی تمام مراحل رشد و نمو گیاهان را تحت تاثیر قرار میدهد. استفادهی بهینه از این تنظیمکنندهها، باعث ارتقای سطح کمی و کیفی گیاهان از جمله گیاهان زینتی میشود. این تنظیمکنندههای رشد گیاهی بهصورت تجاری، برای بهبود کیفیت تولید برخی از گیاهان ارزشمند زینتی از قبیل گلهای شاخهبریده، گیاهان برگ زینتی، گیاهان گلدانی و غیره مورد استفاده قرار میگیرند (شکاری و همکاران، 1384).
چهار گروه تنظیم کننده رشد در کشت بافت گیاهی از اهمیت برخوردار است : اکسینها، سایتوکنینها، جیبرلینها (GA3) و اسید آبسیزیک (ABA). اسکوک و میلر اولین کسانی بودند که گزارش کردند نسبت اکسین به سایتوکنین، نوع و میزان اندامزایی را در کشتهای سلول گیاهی تعیین میکند (مدفورد و همکاران، 1989). معمولاً یک اکسین و یک سایتوکنین به محیطهای کشت افزوده میشود تا ریختزایی صورت گیرد. گرچه نسبت هورمونهای لازم برای انگیزش ریشه و شاخساره همیشه یکسان نیست. گوناگونی قابل توجهی بین جنسها، گونهها و حتی رقمها از نظر نوع و میزان اکسین و سایتوکنین مورد نیازشان برای انگیزش ریختزایی موجود است. جیبرلینها و اسید آبسایزیک گهگاه در محیطهای کشت به کار میروند. به طور کلی جیبرلینها باعث رشد طولی میان گرهها و رشد مریستم یا جوانهها میشوند و افزودن اسید آبسایزیک به محیط کشت برای ممانعت از رشد پینه بر حسب گونه گیاهی یا ترغیب آن و جلوگیری از مراحل آخر نمو رویان است (پیریک، 1376 ، تورز،1377).
1-2-7-1- سایتوکنینها
سایتوکنینها ترکیبات جایگزین آدنین هستند که تقسیم سلولی و سایر فعالیتهای تنظیمکنندگی را شبیه کینتین9 (Kin) تحریک میکنند. این مواد تقریباً در همه گیاهان عالی، خزهها، قارچهای بیماری زا و غیربیماریزا و نیز در tRAN میکروارگانیسمها وسلولهای حیوانی یافت میشوند.
سایتوکنینها در نواحی مریستمی و نواحی دارای پتانسیل رشد زیاد مانند ریشهها، برگهای جوان، میوههای کامل و بذور به مقدار زیاد وجود دارند. به احتمال قوی سایتوکنینهادر ریشهها سنتز شده و به ساقه فرستاده میشوند، زیرا گزارشهای زیادی مبنی بر اینکه سایتوکنینها در شیره آوندهای چوبی وجود دارند، منتشر شده است با این حال وفور سایتوکنین در میوه و بذر نیز احتمال سنتز سایتوکنین در این اندامها را تقویت میکند (آرتکا، 1379).
امروزه بیش از 200 نوع سایتوکنین طبیعی و مصنوعی شناخته شده است (ماتسوبارا، 1990)، معروف‌ترین آن‌ها عبارت‌اند از Kin،BA10، BPA11، ZIP12،TDZ13 (آرتکا، 1379).
فهرست واکنشهای بیولوژیکی که توسط سایتوکنینها فعال میشوند به قرار زیراست :
تقسیم سلولی، اندامزایی، بزرگ شدن سلولها و اندامها و جوانهزنی بذور، نمو جوانه و ساقه، جلوگیری از تخریب کلروفیل، تکامل کلروپلاست، به تعویق انداختن پیری، باز و بسته شدن روزنهها، تکامل جوانهها و شاخهها، انتقال انتخابی مواد غذایی و مواد آلی به بافتهای تیمار شده (آرتکا، 1379، مدفورد و همکاران، 1989 ، ون استادن و همکاران، 1998).
1-2-7-2 کاربرد اکسینها در ریزازدیادی
در کشتهای درونشیشهای، ‌اکسینها معمولا به منظور تحریک تقسیم سلولی و تمایز ریشهها به کار میروند. در ریزازدیادی، اغلب از اکسینهای ایندولاستیکاسید (IAA)، ایندولبوتیریکاسید (IBA)، توفوردی (-D2,4) و تری-کلروفنوکسیاستیکاسید (-T2,4,5) استفاده میشود (کومار و همکاران، 2004). اکسینهای NAA و IAA اغلب به منظور ریشهزایی و یا همراه با یک سیتوکینین برای پرآوری شاخهها استفاده می‌شود. -T2,4,5 و -D4‚2 برای آغازش و رشد کالوس در شرایط درونشیشهای بسیار موثر هستند. -D4‚2 همچنین در جنینزایی سوماتیکی از عوامل مهم به شمار میرود (به جوانی و رازدان، 1996).
اکسین طبیعی (IAA) معمولاً با غلظت 10-01/0 میلیگرم در لیتر و اکسینهای مصنوعی و نسبتاً فعالتر (-D2,4، IBA و NAA) با غلظت 10-001/0 میلیگرم در لیتر در محیطهای کشت به کار میروند (باقری و صفاری، 1388). به طور کلی اکسینها در غلظتهای کم، تشکیل ریشههای نابجا و در غلظتهای زیاد تشکیل کالوس را تحریک میکنند (زیدی و همکاران، 2000؛ کومار و همکاران، 2005).
گزارشات متعددی از کاربرد اکسینها در شرایط درونشیشهای برای اهداف متفاوت وجود دارد. برای مثال سانیوسکی و همکاران (1974) بیان کردند در کشت درونشیشهای سنبل (Hyacinthus sp.) NAA به تنهایی القای ریشه و کالوس را تحریک کرد. به طور کلی،‌ غلظتهای کمتر اکسین در مقایسه با غلظت زیاد سیتوکنینها باعث آغازش و تشکیل شاخساره شده و در حالت عکس باعث تشکیل کالوس و پرآوری سلولها میگردد. اکسینها به تنهایی یا همراه با مقادیر کم و جزئی سیتوکینینها باعث آغازش ریشهها میشوند. اکسین های -D4‚2، NAA، IBA، IAA و پیکلورام جنینزایی سوماتیکی را در گیاهان مختلف باعث میشوند (زیدی و همکاران، ‌2000). سیموندز و کامینگ (1976) با ترکیب BA و NAA موجب انگیزش گیاهکهایی از فلس سوخ شدند. لین و همکاران (1997) به منظور ارزیابی پتانسیل باززایی درونشیشهای گل آلسترومریا (Alestroemeria hybrida) اندامهای مختلف آن را تحت تاثیر تیمارهای مختلف هورمونی شامل NAA و BA قرار دادند. نتایج نشان داد که محیط کشت حاوی 5/2 میلیگرم در لیتر NAA و 5/1 میلیگرم در لیتر BA بیش‌ترین شاخه را تولید نمودند.رحمان و همکاران(2009 ) در بررسی ریزازدیادی ارکید رقم Vanda Tessellata L. به این نتیجه رسیدند که بین غلظت‌های مختلف هورمون‌های گیاهی، هورمون‌های NAA 1.5mgl-1 با BAP1mgl-1 فرمول بهتری را برای طویل شدن شاخه نشان دادند و طویل شدن شاخه‌ها بیشر از 90 درصد مشاهده شده بود به علاوه بیش‌ترین میانگین طول شاخه بعد 28 روز تلقیح 3.9cm و بعد 35 روز تلقیح، 5.9cm بود. موهانتی و همکاران (2012 ) در بررسی ریزازدیادی ارکیده رقم Cymbidium mastersii در شمال شرقی هندوستان در 4 محیط کشت به این نتیجه رسیدند که بهترین نتیجه در استفاده از محیط کشت MS با ترکیب‌ها و غلظت‌های متفاوتی از سیتوکینین ها(BAP و KN ) و اکسین ها (NAA و IBA ) فراهم شده بود، و لازم به ذکر است که منبع اکسین برای تولید ریشه در غلظت‌های پایین خیلی موثر بود. همچنین کونگ و همکاران(2007 ) در بررسی یک روش قابل اطمینان و ساده برای تکثیر درون شیشهای ارکیده رقم Dendrobium Strongylanthum Rchb.f. با افزودن موز له شده و NAA 0.5mgl-1 به محیط2/1 MS نتیجه گرفتند که این ترکیب باعث افزایش تشکیل ریشه و رشد ریشه می‌شود. مونیتوس و به ون (2000) تاثیر مثبت تنظیمکنندههای رشد اکسینی را بر ریزافزایی آکاسیا (Acacia sp.) نشان دادند. اخیرا روش نوینی بر اساس فناوری نانو در حال توسعه و به کارگیریست، در این روش ، نانو ذرات خاصی طراحی و ساخته می‌شوند که تمایل زیادی برای اتصال به ترکیبات مضر موجود در آب یا خاک دارند. از جمله محصولاتی که با موفقیت به تولید انبوه رسیده نانو ذرات لانتانوم بوده است. این نانو ذرات تمایل زیادی برای جذب ترکیبات فسفاتی موجود در آب دارند. با کاربرد این محصول فناوری نانو در مخازن آب کشاورزی به دلیل حذف فسفات، از رشد ناخواسته جلبک‌ها جلوگیری به عمل می‌آید (آلتایر نانو 2005). در همین راستا تحقیقات متعددی در دانشگاه لایت آمریکا در حال انجام می‌باشد. در همین راستا مشخص شده است که نانو ذرات آهن به خاک‌های شدیدا آلوده به ترکیبات سمی باعث کاهش چشم گیر غلظت این آلاینده‌ها می‌گردد. نانو ذرات آهن در این گونه خاک‌ها به دلیل افزایش اکسیداسیون موجب شکسته شدن ترکیبات آلی آلاینده به اجزای کوچک‌تر و ساده تری می‌گردد که به مراتب سمیت کمتری داشته و زودتر تجزیه می‌شوند.(جوزف و همکاران 2006: یو و همکاران 2007). نایوا،2000:دیکسون 1999 در آزمایشی بیان کردن که بیکره هر ویروس از تعداد معینی زیر واحدهای بروتین، پوششی تشکیل شده است. محققان به کمک روش‌های زیست شناسی مولکولی توانستند آنزیم لیباز و بروتین بوششی یک ویروس گیاهی را به یکدیگر متصل نموده و یک بروتین بزرگ‌تر تشکیل دادند این روش به خوبی در شرایط درون شیشه ایی به صورت خود به خودی و منتاژ نانو ذرات نیاز به اعمال انرژی نداشته و به راحتی صورت می پزیرد.
1-2-8- اثر نانوکودها در گیاهان زینتی
صنعت استفاده از گیاهان زینتی از گذشتههای دور بهعنوان یک صنعت سودآور مطرح بوده است. درحال حاضر، اکثر تلاشها و تحقیقات بهسوی افزایش کیفیت گلها و گیاهان زینتی سوق دارد. استفاده از تنظیمکنندههای رشد گیاهی و بسترهای مختلف کشت در ارتقای ویژگیهای کمی و کیفی گیاهان از دیرباز رایج بوده است. در حال حاضر، برخی فناوریهای جدید از جمله بیوتکنولوژی و نانوتکنولوژی به فناوریهای قدیمی افزوده شده یا جایگزین آن‌ها گردیده است. طی سالهای آینده، اغلب جنبههای زندگی انسان، از دستاوردهای فناوری نانو متاثر خواهد شد. بازار جهانی محصولات فناوری نانو در سال 2003، حدود 45 میلیارد دلار بوده است (کازما و ورهاگ، 2006). اولین مجموعه از محصولات نانو در بخش کشاورزی شامل آفتکشها، نسل جدید کودها برای کنترل آفات، بیماریها و علفهای هرز و رساندن دقیق نهادههای کشاورزی به محصول هدف بوده است (پوررحیم و همکاران، 1387).
اثر نامطلوب کودهای شیمیایی بر محیط زیست بر کسی پوشیده نیست. آگاهی از مصرف بهینهی عناصر ضروری (پرمصرف و کممصرف) نقش موثری بر افزایش ویژگیهای کمی و کیفی گیاهان، بهویژه گیاهان زینتی دارد. گیاه ارکید از جمله گیاهان زینتی است که مطالعهای بر روی اثر کودهای نانو بر روی آن انجام نشده است. کاربرد موفقیتآمیز الگوهای گوناگون مرتبط با فناوری نانو در پزشکی و مطالعات آزمایشگاهی، انگیزههای زیادی را در راستای استفاده از فناوری نانو در صنعت کشاورزی (باغبانی) بهوجود آورده است. این فناوریها، امکان آزادسازی کنترلشدهی مواد شیمیایی مورد نیاز را در صنعت کشاورزی فراهم کرده است.
به دلیل اثر مضری که کودهای شیمیایی مرسوم بر محیط زیست و کیفیت محصولات ایجاد میکنند، مدتهاست که استفاده از آن‌ها کاهش یافته است. با بهکارگیری نانوکودها بهعنوان جایگزین کودهای مرسوم، عناصر غذایی نانوکودها بهتدریج و بهصورت کنترلشده در خاک آزاد میشوند. درواقع، فناوری نانو فرصتهای جدیدی را بهمنظور افزایش راندمان مصرف عناصر غذایی و بهحداقل رساندن هزینههای حفاظت از محیط زیست گشوده است (نادری و دانش شهرکی،1390). همچنین بهکمک این فناوری، امکان تولید محصولات با ارزش افزودهی بالاتر و حذف مسمومیت محیطی وجود دارد (گاردتودسدی و همکاران، 2002). دستآوردهای فناوری جدید از جمله نانوتکنولوژی دریچهی جدیدی را بهروی علوم مختلف کشاورزی از جمله زراعت و باغبانی گشوده است. با استفاده از فناوری نانو، درک مناسبتری از زیستشناسی گیاهان حاصل میشود که میتوان با اعمال تغییرات اصلاحی، بر ویژگیهای کمی، کیفی و ارزش غذایی گیاهان زراعی و باغی افزود. بهمنظور تدوین و توسعهی برنامهی فناوری نانو، بهعنوان یکی از اولویتهای کشور، ستاد ویژهای در این ارتباط تشکیل گردید.
گیاه ارکید از جمله گیاهان زینتی است که بهصورت گلدانی و شاخهبریده استفاده میشود. مطالعهای بر روی اثر کودهای نانو بر روی این گیاه زینتی انجام نشده است. نسبت کاربرد کودها با توجه به ویژگیهای هر عنصر و بستر مناسب کشت برای افزایش کیفیت گیاهان زینتی، باید مدنظر قرار گیرد (محبوب خمامی، 1388).
گیاه ارکید از خانوادهی فرفیون است، که اهمیت زیادی در صنعت گیاهان زینتی بهعنوان گیاه گلدانی و شاخهبریده دارد. یکی از عومل موثر بر کیفیت گلهای شاخه بریده و گلدانی، مدیریت تغذیهی گیاه میباشد. دستیابی منابع کودی داخلی در دسترس، ارزان و با کارآیی بیشتر، با استفاده از فناوریهای جدید که بتواند ضمن اقتصادیتر نمودن تولید، منجر به کاهش تلفات کودی و کاهش آلودکی محیط زیست شوند، میتواند از اهمیت خاصی بر خوردار باشد. یکی از مهمترین مزایای این کودها، تقویت گیاه از طریق تامین عناصر ضروری بهویژه عناصر میکرو و افزایش حاصلخیزی خاک است. بهعلاوه، از طریق فناوری نانو، عناصر کممصرف، شرایطی را برای تقویت محیط رشد میکروارگانیسمها و همچنین شرایط مناسب برای رشد گیاه را فراهم میکنند. چنانچه کودهای نانوی داخلی موجب جایگزینی و یا کاهش مصرف کودهای متداول گرانقیمت آهن وارداتی با عدم امکان ساخت در داخل کشور شوند، از جنبهی اقتصادی حایز اهمیت میباشد که نیاز به بررسی دارد. با توجه به ارزش گیاه ارکید، لازم است بهمنظور تعیین بهترین بستر کشت از چند بستر استفاده کرد.
از مزایای کودهای نانو بر کودهای شیمیایی مرسوم میتوان به موارد زیر اشاره کرد: 1) افزایش جذب عناصر غذایی در کودهای نانو و هچنین کودهای با مواد پوششی نانو با خواص رهاکردن کند عناصر، 2) کاهش هزینهی کاربرد و پخش کود در نانوکودهای کندرها، که تنها با یک بار توزیع کود انجام میشود، 3) جلوگیری از تجمع غلظتهای بالای نمکهای محلول در محیط ریشه و جلوگیری از صدمات وارده به گیاه مانند تنش اسمزی، ورس و شکستگی ساقه، سوختگی گیاه، هجوم آفات و بیماریها، بهبود جوانهزنی بذور و کاهش کیفیت محصول، 4) کاهش تبدیل شکل قابل استفاده بهشکل نامطلوب یا غیرقابلاستفاده عناصر در اثر واکنشهای معمول در خاک و 5) کاهش تلفات ناشی از شستشوی عناصر غذایی در محیط ریشه و متعاقبا کاهش آلودگی محیط زیست. فناوری نانو یکی از فناوریهای نوین است که به تازگی وارد عرصهی کشاورزی شده است. اثر مثبت کودهای نانو در افزایش کمیت و کیفیت تعدادی از گیاهان زراعی و باغی مشاهده شده است (لو و همکاران، 2010؛ راکوچیو و سرینگا، 2007؛ بصیری و همکاران، 2011). مصطفی و همکاران (1997) با بررسی تاثیر غلظتهای مختلف آهن بر روی گل داودی نشان دادند که برخی غلظتهای این عنصر موجب بهبود رشد و کیفیت داودی شد.
افزایش بیرویهی مصرف کودهای شیمیایی بهمنظور افزایش میزان محصولات باغی و زراعی، در کنار صنعتیشدن کشورها، دنیا را با خطر آلودگی هر چه بیشتر محیط زیست، روبهرو کرده است. کودهای پرمصرفی مانند نیتروژن و فسفر، سایر عناصر غذایی گیاه را از طرق پوششدارنمودن با مواد متخلخل طبیعی مانند نانورسها، نانوزئولیتها و مواد مصنوعی مانند لایههای پلیمری نازک از جمله نانوکمپوزیتها، موجب توانایی رهاسازی آرام عناصر غذایی در محیط خاک شده و بهعنوان منبعی از عناصر غذایی در پاسخ به نیاز گیاه، بهتدریج و با سرعتی متناسب با نیاز گیاه، آزاد مینمایند. استفاده از ذره یا امولسیونی در ابعاد نانو نیز میتواند موجب افزایش جذب عناصری مانند آهن، منگنز و روی در گیاهان شود (نادری و دانششهرکی، 1390). در بررسی و مقایسه دو کود کلات آهن و نانو کود کلات آهن در غلظتهای مختلف بر روی برخی پاسخهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه ریحان، تأثیر این کودها بر پارامترهای رشد، مقدار رنگیزههای فتوسنتزی برگ، مقدار پروتئین و تغییرات فعالیت برخی آنزیمهای آنتیاکسیدان در برگ مشخص شد (پیوندی و همکاران، 1390). نتایج این تحقیق نشان داد که جایگزینی کود آهن تهیهشده با فناوری نانو در مقایسه با کودهای آهن رایج، در غلظت مناسب یا کمتر نسبت به کود آهن میتواند سبب افزایش ارتقای کمی و کیفی گیاه ریحان شود (پیوندی و همکاران، 1390). در بررسی اثر محلولپاشی کود نانوی کلات آهن بر خصوصیات کمی و کیفی گندم مشخص شد که بسیاری از صفات از جمله تعداد سنبله، تعداد، وزن و عملکرد دانه، ارتفاع بوته و مقدار آهن، کلسیم و روی تحت تاثیر کود نانوی آهن قرار گرفتند (کشاورز و همکاران، 1390). بررسی نانوکود کلات آهن بر عملکرد برنج رقم شیرودی بر صفاتی مانند ارتفاع بوته، تعداد خوشه در بوته، تعداد دانه در خوشه، طول خوشه، وزن خشک، وزن هزار دانه، عملکرد دانه و همچنین صفات کیفی شامل خصوصیات پخت و عملآوری، میزان کلسیم، آهن و روی اثر معنی داشته است (بقایی و همکاران،1390). بررسی فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی در مرزه نشان داد که اعمال تیمارهای مختلف کود کلات آهن و نانو کود کلات آهن، سبب افزایش معنیداری در فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی نسبت به شاهد شد (کمالی جامکانی و همکاران، 1390). نانوکود کلاته آهن باعث افزایش کمیت و کیفیت گوجهفرنگی شد (لبافی و همکاران 1390).
فصل سوم
مواد و روشها
3-1- منبع گیاهی مورد استفاده
در پژوهش حاضر کورم ارکیده از پژوهشکده تخصصی کشاورزی و بیوتکنولوژی هیرکان واقع در شهر آمل تهیه گردید که کورم ها از گیاه مادری گرفته شده بود و به صورت کشت شده در درون شیشه از آزمایشگاه کشت بافت گیاهی در کشور اتریش تولید شده و پس از خریداری به ایران آورده شد و در ایران با اضافه کردن بنزیل آدنین و بنزیل آدنین پورین تولید کورم انجام گرفت.
3-2- روش کار
این مطالعه بر پایه دو آزمایش طرح بلوک‌های کاملا تصادفی که آزمایش اول با 1 فاکتور نانو ذرات آهن با 4 سطح (0، 34/0، 69/0و 139/0میلی گرم بر لیتر) در 4 تیمار و 5 تکرار و 20 پلات آزمایشی و آزمایش دوم با 1 فاکتور مخلوطی از دو هورمون نفتالین استیک اسید و بنزیل آدنین با 4 سطح (5/0، 1 و2 میلی گرم بر لیتر) در 4 تیمار و 5 تکرار و 20 پلت آزمایشی انجام شد که در این آزمایش از محیط موراشیک و اسگوک به روش آب گونه استفاده شد و لازم به ذکر است که هر پلات آزمایشی شامل 4 کورم گیاه ارکید بوده که در داخل شیشه مربا قرار دادیم.
3-3- محیط کشت
در این تحقیق از محیط کشت مایع و جامد MS (موراشیک و اسکوگ، 1962) استفاده شد.

3-3-1- آماده کردن محیط کشت
به منظور تهیه حجم مشخصی از محیط کشت، مقادیر لازم از محلولهای پایه عناصر پرمصرف، کم مصرف، ویتامین‌ها، آهن و تنظیمکنندههای رشد با هم مخلوط شده و بعد از اضافه کردن ساکارز به محلول، pH آن با استفاده از دستگاه pH متر و با کاربرد NaOH یا HCl 1/0 نرمال در محدوده 02/0 ± 7/5 تنظیم گردید. بعد از تنظیم pH،برای محیط جامد، 8 گرم در لیتر آگار به محیط اضافه شده و به همراه یک عدد مگنت روی هیتر دارای شیکر قرار داده شد تا آگار با رسیدن دمای محلول به نزدیک نقطه جوش، کاملا حل گردد. بعد از این مرحله، محلول آماده شده در ظروف شیشهای ریخته شد و درب آنها با سه لایه فویل مسدود گردید. سپس ظروف حاوی محیط کشت در اتوکلاو با دمای 121 درجه سانتی گراد و فشار 1/1 اتمسفر به مدت 20 دقیقه قرار گرفت تا استریل گردند.
3-3-2- ضدعفونی وسایل مورد نیاز
جهت ضدعفونی، وسایل مورد نیاز از قبیل پنس، تیغ اسکالپل، ظروف خالی اعم از پتریدیش و غیره، پس از شستشو با آب معمولی و مایع ظرفشویی، ازطریق آب مقطر آبکشی و خشک شدند. آنگاه توسط فویل مسدود و سپس با قرار دادن درون آون با حرارت خشک 180 درجه سانتیگراد به مدت 3 ساعت ضدعفونی گردیدند.
شکل3-1- ضدعفونی وسایل آزمایشگاهی و محیط کشت در اتوکلاو
3-3-3- آمادهسازی هود (لامینار ایرفلو)
برای شروع آزمایش و نیم ساعت قبل از شروع عملیات، درحالی که تمام ظروف و نمونههای گیاهی به زیر هود منتقل شدند، لامپ ماوراء بنفش موجود در هود روشن گردید. قبل از شروع کار، محیط زیر هود با الکل ضدعفونی گردید. به این صورت تمامی سطوح ضدعفونی شدند. در حین انجام کشت، برای ضدعفونی ابزار مورد استفاده زیر هود، پس از فرو بردن در اتانول 96 درصد از طریق چراغ الکلی شعله داده شدند.
شکل3-2- آماده سازی هود لامینارفلو برای کشت
3-3-4- آمادهسازی محیط کشت کورم ارکیده
برای کشت کورم ارکیده، از محیط کشت مایع و جامد MS و هورمون استفاده گردید. بدین صورت که محیط کشت طبق دستور تهیه ساخته، در حالیکه هورمون به آن اضافه شده بود، تهیه گردید. آنگاه محیط کشت آماده شده داخل شیشه‌های مربا به مقدار 40 میلیلیتر، توزین و پس از استریل کردن با اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتیگراد و فشار 1/1 اتمسفر به مدت 20 دقیقه به زیر هود انتقال داده شدند.
شکل3-3- تهیه محیط کشت برای ارکید
3-3-5- آمادهسازی کورم ارکیده

دسته بندی : پایان نامه ارشد

دیدگاهتان را بنویسید